Metodi di analisi per la valutazione delle caratteristiche microbiologiche e di composizione delle acque minerali naturali e modalità per i relativi prelevamenti dei campioni.
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G.U. 19.1.1993, n. 14
IL MINISTRO DELLA SANITÀ
Visto il decreto legislativo 25 gennaio 1992, n. 105, recante disposizioni per l’attuazione della direttiva n. 80/777/CEE relativa alla utilizzazione e alla commercializzazione delle acque minerali naturali.
Visto in particolare l’art. 2, terzo comma, del citato decreto n. 105, che, ai fini del riconoscimento delle acque minerali naturali, prevede l’emanazione di norme concernenti i metodi di analisi per la valutazione delle caratteristiche microbiologiche e di composizione delle acque minerali stesse e le modalità per i relativi prelevamenti di campioni.
Visto l’art. 34 del regio decreto 28 settembre 1919, n. 1924.
Visto l’art. 6, lettera t), della legge 23 dicembre 1978, n. 833.
Visti gli articoli 1 e 3 del D.C.G. 7 novembre 1939, n. 1856.
Sentito il parere del Consiglio superiore di sanità in data 24 giugno 1992.
Decreta:
CAPO I
Metodi di analisi per la valutazione delle caratteristiche microbiologiche e di composizione delle acque minerali naturali
Art. 1.
Ai fini del riconoscimento delle acque minerali naturali, le analisi microbiologiche debbono essere eseguite secondo le seguenti modalità:
1)
Carica microbica
Seminare in Plate Count Agar (tecnica agar germi) aliquote da 1 ml del campione in quattro piastre di Petri. Incubare due piastre 37°C ± 1° per 24h ± 2h e due piastre a 20°C ± 1° per 72h ± 2h. Procedere alla conta delle colonie.
2)
Coliformi in 250 ml
A)
Metodo con terreno liquido. Seminare due beute provviste di campanula, contenenti ml 125 di brodo lattosato a tripla concentrazione, rispettivamente con ml 25O del campione. Incubare a 37°C ± 1° per 48h ± 2h. Le beute positive (torbidità e presenza di gas) debbono essere sottoposte a subcolture in brodo lattosato-bile verde brillante da incubare a 37°C ± 1° per 48h ± 2h ed a 44°C ± 0,5° per 48h ± 2h. Dalle colture positive procedere all’isolamento su agar Mac Conkey e alle prove biochimiche di conferma (H2S, indolo, ornitina decarbossilasi).
B)
Metodo con membrane filtranti. Filtrare due aliquote di 250 ml ciascuna di campione attraverso membrane filtranti (0.45u). Porre le due membrane, rispettivamente su piastre di "agar lattosato al tergitolo 7" da incubare a 36°C ± 1° per 24h ± 2h e di "agar lattosato al tergitolo 7 + cloruro di trifeniltetrazolio" da incubare a 44°C ± 0.5° per 24h ± 2h.
Prelevare le colonie gialle su AT7 e quelle dal giallo al rosso su AT7 + TTC e seminarle in brodo lattosato-bile verde brillante da incubare rispettivamente a 36°C ± 1° per 48h ± 2h e a 44°C ± 0.5° per 48h ± 2h. Dalle colture positive procedere alle prove di conferma come per il metodo in terreno liquido.
3)
Streptococchi fecali in 250 ml
A)
Metodo con terreno liquido. Seminare 2 beute contenenti ml 125 di brodo glucosio-azide a tripla concentrazione rispettivamente con ml 250 del campione.
Incubare a 37°C ± 1° per 48h ± 2h. Le beute positive (intorbidamento del terreno) debbono essere sottoposte alle prove di conferma mediante striscio in agar bile esculina-azide. lnbubare a 44°C ± 0,5° per 44h ± 4h. Considerare positive le colonie nere catalasi negative.
B)
Metodo con membrane filtranti. Filtrare due aliquote di 250 ml ciascuna del campione attraverso membrane filtranti. Porre le due membrane, rispettivamente, su due piastre di "KF streptococcus agar" da incubare a 37°C ± 1° per 44h ± 4h. Sottoporre le colonie sospette, rosse o rosa, alle prove di conferma come per il metodo in terreno liquido.
4)
Spore di clostridi solfito-riduttori in 50 ml.
Riscaldare ml 50 del campione a 80°C per 10 minuti. Raffreddare rapidamente e filtrare per membrana. Porre la membrana su agar SPS ricoprendo con altri 10 ml di SPS a 45°C. Incubare a 37°C ± 1° per 24h ± 1h in giare per anaerobiosi. La prova viene considerata positiva quando si sviluppano colonie nere. Identificazione presunta di Cl. perfrigens.
Prelevare le colonie sospette (nere) e seminarle in tubi contenenti brodo tioglicollato previamente riscaldato a 100°C per 10 minuti e rapidamente raffreddato. Incubare a 37°C ± 1° per 24h ± 2h ed eseguire subcolture in:
agar nutritivo a becco di clarino, da incubare a 37°C ± 1° per 24h ± 2h in giare per anaerobiosi, per verificare la negatività della catalisi;
provetta di latte tornasolato ricoperto con ml 2 di vaselina, da incubare a 37°C ± 1° per 24-48h per verificare l’acidificazione e la formazione di coagulo frammentato.
5)
Pseudomonas aeruginosa in 250 ml.
Filtrare ml 250 del campione e porre la membrana su agar-cetrimide. Incubare a 37°C ± 1° per 48h ± 2h.
Prelevare le colonie sospette (verdi-bluastre e/o fluorescenti agli UV) e trasferirle su nutrient agar a becco di clarino. Incubare a 42°C ± 0,5° per 48h ± 2h.
Dalla patina procedere:
alla verifica della positività della ossidasi su cartine alla bimetil-p-fenilendiamina;
alla identificazione mediante "galleria" di test biochimici (API 20 NE o equivalenti).
Nei casi dubbi eseguire anche:
l’evidenziazione della produzione di piocianina a 30°C in terreno di King A;
a prova di crescita in Nutrient broth in b.m. a 42°C (ripetuta tre volte);
il test di ossidazione del glucosio a 37°C (Terreno al blu di bromotimolo)
6)
Staphilococcus aureus in 250 ml.
Filtrare ml 250 del campione e porre la membrana su Baird-Parker agar. Incubare a 37°C ± 1° per 24h ± 2h. Prelevare le colonie sospette (nere, generalmente con alone) e seminarle in Brain-Heart infusion broth. Incubare a 37°C ± 1° per 24h ± 2h.
Dalla brodocoltura eseguire:
preparato microscopico previa colorazione di Gram;
semina in profondità in provetta di agar di Mossel e Martin per evidenziare il tipo respiratorio;
test della coagulasi.
Art. 2.
Ai fini del riconoscimento delle acque minerali naturali, le analisi chimiche e fisico chimiche debbono essere eseguite secondo i seguenti metodi di misura:
1)
Residuo fisso a 180°C
Metodo gravimetrico
2)
Ossidabilità
Digestione al permanganato di potassio
3)
Anidride carbonica
Titrimetria a pH 3.8 con indicatore o potenziometro
4)
Silice
Spettrofotometria di assorbimento molecolare
5)
Bicarbonati
Titolazione con pHmetro
6)
Cloruri
Titrimetria con indicatore o potenziometro
Titrimetria con nitrato di mercurio Volumetria sec. Mohr
7)
Solfati
Gravimetria con cloruro di bario Metodo turbidrimetrico
8)
Sodio
Spettrofotometria di assorbimento atomico o di emissione
9)
Potassio
Spettrofotometria di assorbimento atomico o di emissione
10)
Calcio
Spettrofotometria di assorbimento atomico
Titrimetria con EDTA
11)
Magnesio
Spettrofotometria di assorbimento atomico
Titrimetria con EDTA
12)
Ferro disciolto
Spettrofotometria di assorbimento atomico
Spettrofotometria di assorbimento molecolare con I’1-1 o. fenantrolina
13)
Fluoro
Determinazione con elettrodo specifico
Spettrofotometria molecolare del complesso alizarina-lantanio o con alizarina-zirconio
14)
Azoto ammoniacale
Spettrofotometria di assorbimento molecolare con indofenolo o reattivo di Nessler (se necessario dopo distillazione)
15)
Fosforo totale
Spettrofotometria di assorbimento molecolare
16)
Solfuri
Spettrofotometria di assorbimento molecolare con ossalato di p. dimetilamminoanilina
17)
Stronzio
Spettrofotometria di assorbimento atomico
18)
Litio
Spettrofotometria di assorbimento atomico
19)
Alluminio
Spettrofotometria di assorbimento atomico
20)
Bromo
Titrimetria
Spettrofotometria di assorbimento molecolare
21)
Iodio
Titrimetria
Spettrofotometria di assorbimento molecolare
22)
Cianuri
Titrimetria con nitrato d’argento e p-dimetilamminobenzilidenrodanina
Spettrofotometria molecolare con cloramina T e successiva reazione con piridina Metodo con elettrodo specifico
23)
Fenoli (esclusi quelli naturali che non reagiscono con il cloro)
Spettrofotometria molecolare con 4-aminoantipirina o p-nitroanilina Determinazione GC e HPLC
24)
Agenti tensioattivi (MBAS anionici)
Metodo spettrofotometrico al blu di metilene
25)
Oli minerali
idrocarburi disciolti o emulsionati
Estrazione e determinazione con spettrofotometria infrarossa
26)
Idrocarburi aromatici policiclici
Spettrofotometria di fluorescenza dopo purificazione su strato sottile
27)
Pesticidi e bifenili policlorurati
Determinazione per via gas-cromatografica
28)
Composti organoalogenati che non rientrano nella voce pesticidi
Determinazione per via gas-cromato grafica dopo estrazione e con la tecnica dello spazio di testa
29)
Arsenico
Spettrofotometria di assorbimento atomico con la tecnica degli idruri Spettrofotometria molecolare con dietilditiocarbammato di argento
30)
Bario
Spettrofotometria di assorbimento atomico
Metodo turbidimetrico
31)
Borati
Spettrofotometria molecolare con acido carminico
Spettrofotometria di assorbimento atomico
32)
Cadmio
Spettrofotometria di assorbimento atomico
33)
Cromo VI
Spettrofotometria molecolare con difenilcarbazide
Spettrofotometria di assorbimento atomico
35)
Manganese
Spettrofotometri di assorbimento atomico
Spettrofotometria di assorbimento molecolare con formalossima o persolfato di ammonio
36)
Nitrati
Spettrofotometria molecolare al salicilato di sodio
Spettrofotometria molecolare diretta all’a.v. 210 nm
37)
Nitriti
Spettrofotometria molecolare con acido solfanilico e ammina
38)
Piombo
Spettrofotometria di assorbimento atomico
39)
Rame
Spettrofotometria di assorbimento atomico
40)
Selenio
Spettrofotometria di assorbimento atomico con la tecnica degli idruri Spettrofotometria molecolare al 2.3 diaminonaftalene
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Per eseguire le analisi del presente articolo si può utilizzare, quando possibile, la cromatografia ionica.
CAPO II
Modalità per il prelevamento dei campioni
Art. 3.
Il prelevamento dei campioni delle acque minerali naturali, da analizzare ai fini della valutazione delle caratteristiche microbiologiche e di composizione delle stesse, è effettuato dal personale tecnico laureato del laboratorio che esegue le analisi.
Art. 4.
Il prelevamento è effettuato alla presenza dell’autorità sanitaria competente per territorio, che redige il verbale di prelevamento.
Art. 5.
Il verbale di prelevamento deve indicare l’ora e la data del prelevamento stesso, le generalità e le qualifiche dei presenti, la descrizione dell’opera di captazione e la sua esatta ubicazione nel territorio, le modalità di prelevamento, i risultati delle determinazioni eseguite sul posto, i dati meteorologici e pluviometrici, anche relativi ai giorni precedenti, precisando in particolare la data e la durata delle ultime precipitazioni, ed ogni altro elemento ritenuto utile; il verbale è firmato dai presenti al prelevamento.
Art. 6.
Il presente decreto sarà pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica.
Roma, 13 gennaio 1993
p. Il Ministro: AZZOLINI
