Approvazione del metodo ufficiale di analisi per la determinazione della vitamina B1 negli alimenti per animali – Supplemento n. 19.
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Gazzetta Ufficiale N. 50 del 1 Marzo 2006
IL MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE E FORESTALI
Ispettorato centrale repressione frodi
di concerto con
IL MINISTERO DELL’ECONOMIA
E DELLE FINANZE
IL MINISTERO DELLA SALUTE
IL MINISTERO DELLE ATTIVITA’ PRODUTTIVE
Visti l’art. 43 del regio decreto-legge 15 ottobre 1925, n. 2033,
convertito nella legge 18 marzo 1926, n. 562, riguardante la
repressione delle frodi nella preparazione e nel commercio di
sostanze di uso agrario e di prodotti agrari, e l’art. 108 del
regolamento di esecuzione dello stesso R.D.L., approvato con regio
decreto 1° luglio 1926, n. 1361, i quali prescrivono che le analisi
occorrenti in applicazione delle norme contenute nelle suddette
disposizioni nazionali dovranno essere eseguite dai laboratori
incaricati con i metodi prescritti da questo Ministero, di concerto
con il Ministero delle finanze, il Ministero della sanita’ ed il
Ministero dell’industria, del commercio e dell’artigianato;
Visti gli articoli 110, 111 e 112 del decreto del Presidente della
Repubblica 12 febbraio 1965, n. 162, che prevedono, rispettivamente,
l’istituzione presso questo Ministero di una commissione di studio
per l’aggiornamento dei metodi ufficiali di analisi relativi ai
prodotti disciplinati dal citato R.D.L., la presenza in qualita’ di
componenti di detta commissione di rappresentanti dei Ministeri
concertanti e di enti o istituti specializzati nei settori e la
possibilita’ che la commissione stessa sia articolata in
sottocommissioni composte da esperti competenti per singole materie;
Visto il decreto-legge 18 giugno 1986, n. 282, convertito, con
modificazioni, nella legge 7 agosto 1986, n. 462, che all’art. 10 ha
previsto l’istituzione dell’Ispettorato centrale repressione frodi
presso il Ministero dell’agricoltura e delle foreste per l’esercizio,
tra l’altro, delle funzioni inerenti alla prevenzione e repressione
delle infrazioni nella preparazione e nel commercio dei prodotti
agroalimentari e delle sostanze di uso agrario e forestale;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 18 gennaio 1988,
che tra le funzioni attribuite alle divisioni dell’Ispettorato
centrale repressione frodi ha previsto l’elaborazione ed
aggiornamento dei metodi ufficiali di analisi per i prodotti
agroalimentari e le sostanze di uso agrario e forestale;
Visto il decreto-legge 11 gennaio 2001, n. 1, convertito, con
modificazioni, nella legge 9 marzo 2001, n. 49, che all’art. 3, comma
3, stabilisce che l’Ispettorato centrale repressione frodi e’ posto
alle dirette dipendenze del Ministro delle politiche agricole e
forestali, opera con organico proprio ed autonomia organizzativa ed
amministrativa e costituisce un autonomo centro di responsabilita’ di
spesa;
Visto il decreto del Ministro delle politiche agricole e forestali
13 febbraio 2003, n. 44, modificato con il decreto 11 novembre 2004,
n. 294, con il quale, ai sensi dell’art. 2 della legge 19 gennaio
2001, n. 3, e’ stato emanato il Regolamento di riorganizzazione della
struttura operativa dell’Ispettorato centrale repressione frodi,
riconfermando, tra le funzioni attribuite agli uffici
dell’amministrazione centrale, l’elaborazione e l’aggiornamento dei
metodi ufficiali di analisi per i prodotti agroalimentari e le
sostanze di uso agrario e forestale;
Visto il Regolamento (CE) n. 1831/2003 del Parlamento europeo e del
Consiglio il quale individua, nella categoria degli additivi
nutrizionali destinati all’alimentazione animale, le vitamine, in
quanto il loro apporto nella dieta favorisce lo sviluppo ed il
mantenimento della vita;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 2 novembre 2001,
n. 433, concernente il Regolamento di attuazione di talune direttive
in materia di additivi nell’alimentazione animale, il quale, agli
articoli 17 e 18, prescrive che il contenuto delle vitamine diverse
dalla A, D ed E, deve essere indicato in etichetta qualora dette
sostanze sono aggiunte alle premiscele ed agli alimenti per animali e
sono dosabili secondo metodi ufficiali di analisi;
Visto il decreto legislativo 17 giugno 2003, n. 223, relativo
all’organizzazione dei controlli ufficiali nel settore
dell’alimentazione animale, che impone in fase di commercializzazione
il controllo ufficiale degli additivi, delle premiscele e degli
alimenti per animali in relazione all’identita’ ed al contenuto degli
additivi incorporati;
Visto il Regolamento (CE) n. 882/2004 del Parlamento europeo e del
Consiglio in materia di controlli ufficiali nei mangimi e negli
alimenti, che dispone all’art. 11 Capo III: Campionamento ed analisi,
che i metodi di analisi devono essere caratterizzati, quando
possibile, da opportuni criteri di precisione;
Visto il decreto ministeriale 21 settembre 1971, con il quale sono
stati approvati i «Metodi ufficiali di analisi degli alimenti per uso
zootecnico», modificati ed integrati da ultimo con il decreto
ministeriale 9 settembre 2004 – Supplemento n. 18;
Ritenuto necessario integrare la raccolta dei suddetti metodi
ufficiali nazionali con un metodo di analisi, rapido e preciso,
idoneo al controllo del contenuto della vitamina B1 aggiunta alle
premiscele ed agli alimenti per animali;
Considerato il decreto del Ministero della sanita’ 21 febbraio
2001, con il quale sono state fissate le tolleranze in caso di
divergenze tra il risultato del controllo ufficiale ed il tenore
dichiarato, nelle premiscele e negli alimenti per animali, degli
additivi appartenenti al gruppo delle vitamine, tra cui la vitamina
B1;
Sentita la sottocommissione per l’aggiornamento periodico dei
metodi ufficiali di analisi relativi agli alimenti per gli animali,
nominata con decreto ministeriale 28 settembre 2000;
Vista la direttiva 98/34/CE e successive modifiche, che prevede una
procedura d’informazione nel settore delle norme e regolamentazioni
tecniche;
Decreta:
Art. 1.
1. E’ approvato il metodo ufficiale di analisi relativo alla
determinazione del contenuto di vitamina B1 nelle premiscele e negli
alimenti per animali, descritto nel Supplemento n. 19, allegato al
presente decreto.
2. Il metodo descritto nell’allegato al presente decreto si applica
al controllo dei prodotti nazionali.
Art. 2.
Il presente decreto sara’ pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della
Repubblica italiana ed entra a far parte della raccolta ufficiale dei
metodi nazionali.
Il presente decreto entra in vigore il giorno successivo alla sua
pubblicazione.
Roma, 20 febbraio 2006
p. Il Ministero delle politiche agricole e forestali
– L’ispettore Generale Capo per la repressione delle frodi
Lo Piparo
p. Il Ministero dell’economia e delle finanze
Il Direttore generale dell’Agenzia delle dogane
Guaiana
p. Il Ministero della salute –
Il Direttore generale della sanita’ veterinaria e degli alimenti
Marabelli
p. Il Ministero delle attivita’ produttive
Il Direttore generale per lo sviluppo produttivo
e la competitivita’
Goti
Allegato
METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO UFFICIALE
DEGLI ALIMENTI PER ANIMALI
Supplemento n. 19
Determinazione della vitamina B1
DETERMINAZIONE DELLA VITAMINA B1
1. Scopo e campo di applicazione.
Il metodo serve per la determinazione della vitamina B1 negli
alimenti per animali e nelle premiscele.
Il limite di quantificazione e’ 5 mg/kg.
2. Principio.
La vitamina viene estratta a caldo con acido cloridrico diluito,
ossidata a tiocromo, purificata e quindi determinata mediante
cromatografia liquida ad alta risoluzione a fase inversa (RP-HPLC)
utilizzando un rivelatore a fluorescenza.
3. Reagenti e materiali.
3.1. Acido cloridrico 37% p.a.
3.1.1. Soluzione 0,01 N
3.1.2. Soluzione 1 N
3.1.3. Soluzione 6 N
3.2. Acqua per HPLC
3.3. Sodio acetato 3H2O p.a.
3.3.1. Soluzione acquosa 2,5 M
3.4. Acido tricloroacetico p.a.
3.4.1. Soluzione acquosa al 50%
3.5. Sodio idrossido p.a.
3.5.1. Soluzione acquosa al 15%
3.6. Ferricianuro di potassio [K3Fe(CN)6] p.a.
3.7. Reattivo ossidante (preparare al momento dell’uso):
soluzione all’l% di ferricianuro di potassio (3.6.) in sodio
idrossido (3.5.1.)
3.8. Potassio fosfato bibasico anidro (K2HPO3) p.a.
3.9. Acido ortofosforico 85% p.a.
3.10. Tampone fosfato 5 mM a pH 7,0: g 0,871 di potassio fosfato
bibasico (3.8.) in 800 ml di acqua (3.2.);
aggiustare a pH 7,0 con acido ortofosforico (3.9.) e portare a
1000 ml con acqua. (3.2.)
3.11. Acetonitrile per HPLC
3.12. Metanolo per HPLC
3.13. Soluzione di lavaggio per cartucce SPE: soluzione al 5% di
metanolo (3.12.) in tampone fosfato (3.10.) (v/v)
3.14. Fase mobile: miscela tampone fosfato (3.10.): acetonitrile
(3.11.) 70 30 (v/v)
3.15. Tiamina cloridrato purissimo
3.15.1. Soluzione standard stock: pesare 50 mg di tiamina
(3.15.) con l’approssimazione di 0,1 mg in un matraccio tarato da
100 ml, sciogliere con HC1 0,01 N (3.1.1.) e portare a volume. La
soluzione, conservata al buio in frigorifero, e’ stabile 1 mese
3.16. Cartine indicatrici di pH
3.17. Filtri di carta rapidi
3.18. Cartucce per purificazione SPE C18 500 mg
4. Strumentazione.
4.1. Bagno termostatico ad acqua od autoclave
4.2. Cromatografo liquido con rivelatore fluorimetrico
4.2.1. Colonna C18 ODS2 250×4,6 mm con relativa precolonna
5. Modo di operare.
5.1. Preparazione del campione.
Per la preparazione dell’aliquota da sottoporre ad analisi,
procedere come indicato nei metodi di analisi per il controllo
ufficiale degli alimenti per animali di cui al decreto ministeriale
25 maggio 1982 – punto 1 del Supplemento n. 6- pubblicato nella
Gazzetta Ufficiale n. 265 del 25 settembre 1982.
5.2. Estrazione del campione:
5.2.1. Pesare (con l’approssimazione di 0,01g) da 5 a 20 grammi
di campione, a seconda del contenuto di vitamina B1, in un matraccio
da 200 ml. Addizionare 100 ml di HC1 1 N (3.1.2.). Agitare per
15 minuti, verificare con la cartina (3.16.) che il pH sia inferiore
a 3; altrimenti aggiungere 5 ml di HC1 6 N (3.1.3.), agitare per 15
minuti e verificare di nuovo il pH; se necessario, procedere con
ulteriori aggiunte di HC1 6 N (3.1.3.).
5.2.2. Porre il matraccio in bagno termostatico ad acqua
bollente od in autoclave in corrente di vapore per 5 minuti.
Aggiungere 10 ml di soluzione di sodio acetato (3.3.1.) e agitare.
Aggiungere 2 ml di soluzione di acido tricloroacetico (3.4.1.).
Scaldare a 90°C per 15 minuti. Raffreddare, portare a volume con
acqua e filtrare su filtro di carta (3.17.). Il filtrato, puo’ essere
utilizzato il giorno seguente se conservato in frigorifero.
5.3. Ossidazione del campione.
Porre in un matraccio da 20 ml un’aliquota del filtrato,
eventualmente diluito con acqua, contenente da 5 a 10µg di vitamina
B1 e portare il volume a 10 ml con acqua; aggiungere 5 ml di reattivo
ossidante (3.7.), agitare per 60 secondi esatti, aggiungere 1 ml di
acido ortofosforico (3.9.) mescolare e portare a volume con acqua.
5.4. Purificazione del campione.
Attivare la cartuccia SPE (3.18.) facendo passare 2 ml di
metanolo (3.12.), seguiti da 2 ml di acqua (3.2.). Far passare
attraverso la cartuccia 5 ml di soluzione preparata come in (5.3.),
lavare la cartuccia con 3 ml di soluzione di lavaggio (3.13.)
scartando l’eluato ed evitando di mandare a secco la cartuccia.
Eluire il tiocromo con 5 ml di metanolo (3.12.), raccogliere l’eluato
in un matraccio da 5 ml e portare a volume con metanolo.
6. Preparazione delle soluzioni di taratura.
6.1. Preparazione delle soluzioni standard di lavoro: porre 1 ml
della soluzione standard stock (3.15.1.) in un matraccio da 100 ml e
portare a volume con acqua, da questa soluzione preparare le
soluzioni standard di lavoro aventi concentrazioni comprese tra 0,5 e
2,5µg/ml.
6.2. Ossidazione.
Porre 5 ml di ciascuna soluzione standard di lavoro (6.1.) in un
matraccio da 20 ml, aggiungere 5 ml di acqua e 5 ml di reattivo
ossidante (3.7.), agitare per 60 secondi esatti, aggiungere 1 ml di
acido ortofosforico (3.9.) mescolare e portare a volume.
6.3. Purificazione.
Per ciascuna soluzione standard di lavoro procedere come al punto
(5.4.).
7. Cromatografia.
Iniettare 50µl delle soluzioni come preparate in (5.4.) e (6.3.)
nel cromatografo, alle seguenti condizioni di lavoro: temperatura
della colonna: ambiente; velocita’ di flusso della fase mobile: 0,6
ml/min.; rivelazione fluorimetrica: lambda di eccitazione: 360 nm,
lambda di emissione: 430 nm.
8. Calcolo dei risultati.
Determinare la concentrazione di vitamina B1 in µg/ml nella
soluzione campione, interpolando sulla curva di taratura, costruita
riportando sulle ascisse i valori delle aree dei picchi
corrispondenti alle soluzioni standard e sulle ordinate le relative
concentrazioni, il valore dell’area del picco della soluzione
campione. Il contenuto di vitamina B1 del campione (C) espresso in
mg/kg si ottiene tenendo conto delle diluizioni effettuate in base
alla seguente formula:
C (mg/kg) = c * d/m
dove:
c = contenuto in vitamina B1 (µg/ml) della soluzione campione,
ottenuto per interpolazione
d = fattore di diluizione
m = massa, in grammi, dell’aliquota del campione sottoposta ad
analisi.
9. Risultati statistici di uno studio collaborativo.
E’ stato organizzato uno studio collaborativo (anno 2003) nel
quale 11 laboratori hanno analizzato una premiscela, un mangime
minerale complementare ed un mangime completo (8 laboratori). Su ogni
tipologia di prodotto sono state eseguite 3 determinazioni.
La seguente tabella riporta i risultati ottenuti:
