Recentemente il Ministero della Salute ha emanato un Decreto che aggiorna i criteri di valutazione delle Acque Minerali Naturali. Tale documento risulta essere di notevole importanza per tutti i colleghi che operano nel settore e nella sicurezza degli alimenti quindi di seguito si riporta l’intera norma compresi gli Allegati.
Decreto Ministeriale 10/02/2015
Criteri di valutazione delle caratteristiche delle acque minerali naturali
Documento di Origine Nazionale emanato dal Ministero della Salute e pubblicato sulla Gazzetta Ufficiale Italiana n° 50 del 02/03/2015.
IL MINISTRO DELLA SALUTE
Visto il decreto legislativo 8 ottobre 2011, n. 176, recante disposizioni per l’attuazione della direttiva 2009/54/CE, relativo alla utilizzazione e alla commercializzazione delle acque minerali naturali;
Visto in particolare il comma 1 dell’art. 3 del citato decreto legislativo 8 ottobre 2011, n. 176, che prevede, per la determinazione dei criteri di valutazione delle caratteristiche delle acque minerali naturali, la adozione di un decreto del Ministro della salute;
Visto il decreto del Ministro della sanità 12 novembre 1992, n. 542 e successive modificazioni, concernente il regolamento recante i criteri di valutazione delle caratteristiche delle acque minerali naturali;
Visto il decreto del Ministro della salute 29.12.2003 recante disposizioni per l’attuazione della direttiva n. 2003/40/CE della Commissione nella parte relativa ai criteri di valutazione delle caratteristiche delle acque minerali naturali di cui al decreto ministeriale 12 novembre 1992, n. 542, e successive modificazioni, nonché alle condizioni di utilizzazione dei trattamenti delle acque minerali naturali e delle acque di sorgente;
Acquisiti i pareri della III Sezione del Consiglio superiore di sanità espressi nella sedute del 19 marzo 2013 e del 13 novembre 2013;
Esperita con esito positivo la procedura di informazione nel settore delle norme e delle regolamentazioni tecniche di cui alla direttiva 98/34/CE, e successive modificazioni, notifica 2013/0268/I, e ravvisato che la Commissione europea, a conclusione delle consultazioni scritte, ha riconosciuto che con il progetto di regola tecnica notificata non si intende introdurre alcun ostacolo alla libera circolazione dei prodotti;
Acquisito il parere della III Sezione del Consiglio superiore di sanità espresso nella seduta del 13 gennaio 2015;
Decreta:
Art. 1
Criteri di valutazione delle caratteristiche geologiche e idrogeologiche delle acque minerali naturali
1. A corredo delle domande di riconoscimento delle acque minerali naturali deve essere prodotta una relazione idrogeologica volta a illustrare tutti gli aspetti caratterizzanti la falda acquifera d’origine.
2. La relazione deve fare riferimento alla cartografia ufficiale esistente e deve comprendere:
a) definizione del bacino imbrifero geografico e idrogeologico con carta geologica e idrogeologica e profili geologici e idrogeologici significativi in scala minima 1:25.000;
b) definizione del regime termopluviometrico dell’area di ricarica dell’acquifero, svolta utilizzando le medie mensili di temperatura atmosferica e altezze di pioggia cumulata, riferite agli ultimi dieci anni;
c) carta di permeabilità dei complessi idrogeologici in scala minima 1:25.000;
d) prove di portata;
e) schema idrogeologico dell’area di ricarica;
f) progetto preliminare dell’opera di presa;
g) bilancio idrogeologico, radio-attinologia dO18, dD, Tritio, valutazione delle caratteristiche idrauliche della falda, studio della mineralizzazione della falda e delle variazioni chimiche e chimico-fisiche nelle quattro stagioni per almeno dodici mesi;
h) piano topografico, in scala minima 1:5.000, esteso, compatibilmente con la natura e l’ubicazione dei terreni, per almeno 5 kmq intorno all’opera di presa, con la geologia di dettaglio e relativa carta e sezioni rappresentative geologiche e idrogeologiche;
eventuale possibilità di rapporti della falda con zone a rischio di inquinamento e con altre captazioni concesse;
i) definizione dell’area di protezione e salvaguardia dell’area di captazione;
l) piano particolareggiato, con curve di livello, della zona circostante la captazione, con carta in scala minima 1:1.000 e sezioni geologiche delle quali risultino i criteri adottati per la salvaguardia dell’opera di presa e della falda da possibili elementi inquinanti esterni;
m) a dimostrazione della non interferenza di altre falde sulla falda minerale, la relazione deve essere integrata con documentazione idrogeologica, chimica, chimico-fisica e isotopica (dO18 , dD, Tritio) su campioni prelevati nelle condizioni di naturale variabilità stagionale.
3. La provenienza dalla stessa falda di più opere di presa o punti d’acqua deve essere dimostrata con esauriente documentazione idrogeologica, chimica, chimico-fisica e isotopica.
4. Nel caso di richieste di riconoscimento, come acque minerali naturali, di acque sorgive o sotterranee captate nell’ambito della stessa concessione mineraria nella quale scaturiscono una o più acque minerali riconosciute, la documentazione sopra elencata deve essere integrata con i dati relativi a:
a) per le acque per le quali si chiede il riconoscimento e per tutte quelle già riconosciute all’interno della stessa concessione: analisi dei parametri chimico-fisici (temperatura, pH, Eh, conducibilità), analisi dei costituenti chimici maggiori (Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4, HCO3), eventualmente analisi dei costituenti chimici minori che il richiedente ritenga possano essere distintivi di quella particolare acqua, analisi isotopiche (dO18 , dD, Tritio). Il campionamento dovrà essere effettuato con frequenza mensile e simultaneamente o al massimo nell’arco di 1-3 giorni per tutte le acque;
b) monitoraggio dei parametri climatici principali (precipitazioni e temperatura dell’aria) nell’ambito della concessione per un intero ciclo idrologico (1 anno); campionamento mensile delle precipitazioni «cumulate» ed esecuzione di analisi isotopiche (dO18 , dD, Tritio) da effettuare con cadenza mensile per un intero ciclo geologico (1 anno).
Art. 2
Criteri di valutazione delle caratteristiche chimiche, chimico-fisiche e organolettiche delle acque minerali naturali
1. Le domande di riconoscimento delle acque minerali naturali debbono essere corredate dai certificati di almeno quattro analisi chimiche, chimico-fisiche e organolettiche eseguite nelle quattro stagioni su campioni prelevati alla sorgente (ovvero alle singole sorgenti se l’acqua proviene da più sorgenti, in tale caso, anche alla miscelazione delle singole sorgenti) e dai relativi verbali di prelevamento redatti dall’autorità sanitaria che ha assistito ai prelevamenti stessi.
2. Le analisi di cui al comma 1 sono effettuate dai laboratori pubblici di cui al decreto del Capo del Governo 7.11.1939, recante disposizioni concernenti le analisi delle acque minerali pubblicato nella Gazzetta Ufficiale 28 novembre 1939, n. 276.
3. Dai certificati di analisi devono risultare le caratteristiche organolettiche nonché la determinazione dei seguenti parametri dell’acqua minerale:
1. Temperatura alla sorgente
2. Concentrazione degli ioni idrogeno (pH) alla temperatura dell’acqua alla sorgente
3. Conducibilità elettrica specifica a 20°C
4. Residuo fisso a 180°C
5. Ossidabilità
6. Anidride carbonica libera alla sorgente
7. Silice
8. Bicarbonati
9. Cloruri
10. Solfati
11. Sodio
12. Potassio
13. Calcio
14. Magnesio
15. Ferro disciolto
16. Ione ammonio
17. Fosforo totale
18. Grado solfidrimetrico espresso come H2S
19. Stronzio
20. Litio
21. Alluminio
22. Bromuri
23. Ioduri
4. Dalle analisi chimiche deve inoltre risultare la determinazione dei seguenti parametri, il cui limite massimo ammissibile è di fianco indicato; tali parametri si riferiscono a sostanze di origine naturale e non devono derivare da un’eventuale contaminazione della fonte:
(*) Le caratteristiche di prestazione delle metodiche analitiche per la determinazione dei parametri di cui al comma 4 sono riportate nell’allegato I.
5. Limitatamente ai parametri di cui all’art. 2, comma 4, le acque minerali naturali, provenienti da più sorgenti, devono essere conformi ai limiti di concentrazione massima ammissibile sopra indicati, al momento del confezionamento.
6. Nelle acque minerali naturali non devono essere presenti le seguenti sostanze o composti derivanti dall’attività antropica; il mancato riscontro di tali sostanze, utilizzando metodi analitici con i livelli minimi di rendimento riportati nell’allegato II, costituisce garanzia di qualità per l’acqua minerale:
1. Agenti tensioattivi
2. Oli minerali-idrocarburi disciolti o emulsionati
3. Benzene
4. Idrocarburi policiclici aromatici
5. Antiparassitari
6. Policlorobifenili
7. Composti organoalogenati (che non rientrano nelle voci 5 e 6)
7. Le sostanze di cui al comma 6 non devono risultare rilevabili con metodi che abbiano i limiti minimi di rendimento analitico riportati nel citato allegato II. Tali limiti di rendimento devono corrispondere a segnali strumentali rivelabili (cioè a livelli di fiducia del 95% in rapporto a un dosaggio in bianco). I metodi da utilizzarsi devono essere quelli che si avvalgono delle più moderne tecniche analitiche e che sono indicati da organismi internazionali o comunitari o nazionali. I livelli minimi di rendimento riportati saranno riesaminati alla luce di nuove metodologie analitiche.
Art. 3
Trattamento con aria arricchita di ozono
1. Fatte salve le disposizioni di cui all’art. 8 del Decreto legislativo 8 ottobre 2011, n. 176, l’intenzione di avviare al trattamento le acque minerali naturali, riconosciute alla data di entrata in vigore del presente provvedimento, con aria arricchita di ozono per la separazione dei composti del ferro, del manganese, dello zolfo e dell’arsenico deve essere comunicata al Ministero della salute, Direzione generale della prevenzione, prima dell’avvio stesso. Alla domanda i soggetti titolari di riconoscimento di acque minerali naturali debbono allegare tutta la documentazione utile a definire le caratteristiche del trattamento, ivi comprese le prestazioni e la potenzialità dell’impianto, e la rispondenza ai criteri di garanzia di cui al successivo comma 4.
2. Decorsi novanta giorni dalla ricezione della comunicazione di cui al comma 1 senza che il Ministero della salute, sentito il Consiglio superiore di sanità, abbia adottato alcun provvedimento il trattamento può avere luogo.
3. Le domande di riconoscimento delle acque minerali naturali, qualora si intenda far ricorso al trattamento, debbono essere inoltre corredate da tutta la documentazione utile a definire le caratteristiche del trattamento, ivi comprese le prestazioni e la potenzialità dell’impianto, e la rispondenza ai criteri di garanzia di cui al successivo comma 4.
4. Fatte salve le disposizioni di cui agli artt. 6 e 7 del decreto legislativo 8 ottobre 2011, n. 176, il trattamento di cui ai commi 1 e 3 deve soddisfare l’insieme delle seguenti condizioni:
a) la composizione chimica e chimico-fisica delle acque minerali naturali giustifica l’avvio al trattamento;
b) sono adottate tutte le misure necessarie a garantire l’innocuità e l’efficacia del trattamento;
c) la composizione chimica e chimico-fisica delle acque minerali naturali in componenti caratteristiche non è modificata dal trattamento;
d) l’acqua minerale naturale prima del trattamento rispetta i criteri microbiologici di cui all’art. 4;
e) il trattamento non provoca la formazione di residui a una concentrazione superiore ai limiti massimi stabiliti nell’allegato III o di residui che possono presentare un rischio per la salute pubblica.
5. Le disposizioni di cui ai commi 1 e 3 si applicano anche alle acque di sorgente.
Art. 4
Criteri di valutazione delle caratteristiche microbiologiche delle acque minerali naturali
1. Le domande di riconoscimento delle acque minerali naturali debbono essere corredate dai certificati di almeno quattro analisi microbiologiche eseguite nelle quattro stagioni su campioni prelevati alla sorgente (ovvero alle singole sorgenti se l’acqua proviene da più sorgenti, in tale caso, anche alla miscelazione delle singole sorgenti), e dai relativi verbali di prelevamento redatti dall’autorità sanitaria che ha assistito ai prelevamenti stessi.
2. Le analisi di cui al comma 1 sono effettuate dai laboratori pubblici di cui al Decreto del Capo del Governo 7.11.1939, recante disposizioni concernenti le analisi delle acque minerali pubblicato nella Gazzetta Ufficiale 28 novembre 1939, n. 276.
3. Dalle analisi deve risultare:
1) assenza di coliformi e di Escherichia coli in 250 ml a 37°C e a 44,5°C, accertata su semina in due repliche da 250 ml;
2) assenza di Streptococchi fecali in 250 ml, accertata su semina in due repliche da 250 ml;
3) assenza di anaerobi sporigeni solfito-riduttori in 50 ml, accertata su unica semina;
4) assenza di Staphylococcus aureus in 250 ml, accertata su unica semina;
5) assenza di Pseudomonas aeruginosa in 250 ml, accertata su unica semina.
4. Debbono inoltre essere determinati i valori della carica microbica totale a 20-22°C dopo 72 ore e a 37°C dopo 24 ore; i valori risultanti da dette determinazioni non devono normalmente superare 20 UFC/ml alla temperatura di 20-22°C in 72 ore e 5 UFC/ml a 37°C in 24 ore, fermo restando che tali valori sono considerati indicativi e non concentrazioni massime.
5. I metodi da utilizzarsi per la ricerca dei parametri di cui ai commi 3 e 4 devono essere quelli indicati nell’allegato IV.
6. Il giudizio favorevole dei parametri di cui ai commi 3 e 4 indica che l’acqua può essere considerata esente da microrganismi patogeni.
7. L’assenza di specifici parassiti e di specifici microrganismi patogeni (allegato IV, paragrafo 2.7) deve essere accertata solo in caso di rischio di contaminazione.
Art. 5
Criteri di valutazione delle caratteristiche cliniche e farmacologiche delle acque minerali naturali
1. La natura degli esami, cui si deve procedere secondo metodi scientifici riconosciuti, deve essere adattata alle caratteristiche proprie dell’acqua minerale naturale e ai suoi effetti sull’organismo umano, quali ad esempio, la diuresi, il funzionamento gastrico o intestinale, la compensazione delle carenze di sostanze minerali.
2. Eventualmente, la constatazione della costanza e della concordanza di un gran numero di osservazioni cliniche può sostituire gli esami di cui al comma 1; in casi appropriati gli esami clinici possono sostituirsi agli esami considerati al comma 1, a condizione che la costanza e la concordanza di un gran numero di osservazioni consentano di ottenere gli stessi risultati.
3. Gli studi clinici e farmaco-tossicologici debbono essere condotti presso strutture universitarie o aziende sanitarie o enti di ricerca pubblici o privati accreditati nel rispetto delle regole di buona pratica clinica e di buona pratica di laboratorio.
4. Per le richieste relative alla possibilità di utilizzo dell’acqua minerale per la ricostituzione degli alimenti per i lattanti, gli studi clinici sperimentali possono essere sostituiti da una relazione bibliografica che, basandosi sulle caratteristiche chimiche dell’acqua, ne indichi le predette proprietà.
5. Le richieste relative alla possibilità di utilizzo dell’acqua minerale nell’alimentazione dei lattanti dovranno essere documentate da studi clinici e farmaco-tossicologici (questi ultimi non sono necessari per acque già riconosciute come minerali) eseguiti presso strutture di cui al comma 3.
6. I recipienti contenenti l’acqua da sottoporre alle prove cliniche e farmaco-tossicologiche debbono pervenire ai responsabili delle sperimentazioni sigillati dall’autorità sanitaria che ha provveduto ai prelevamenti e accompagnati dal verbale di prelevamento redatto dalla stessa autorità sanitaria.
Art. 6
Modalità per il prelevamento dei campioni
1. Il prelevamento dei campioni delle acque minerali naturali da analizzare ai fini della valutazione delle caratteristiche microbiologiche e di composizione delle stesse è effettuato dal personale tecnico del laboratorio che esegue le analisi.
2. Il prelevamento è effettuato alla presenza dell’autorità sanitaria competente per territorio, che redige il verbale di prelevamento.
3. Il verbale di prelevamento deve indicare l’ora e la data del prelevamento stesso, le generalità e le qualifiche dei presenti, la descrizione dell’opera di captazione e la sua esatta ubicazione nel territorio, le modalità di prelevamento, i risultati delle determinazioni eseguite sul posto, i dati meteorologici e pluviometrici anche relativi ai giorni precedenti, precisando in particolare la data e la durata delle ultime precipitazioni, e ogni altro elemento ritenuto utile; il verbale è firmato dai presenti al prelevamento.
Art. 7
Verifica del permanere delle caratteristiche proprie delle acque minerali naturali riconosciute
1. Ai fini della verifica del permanere delle caratteristiche proprie dell’acqua minerale naturale, i soggetti titolari di riconoscimento devono inviare, ogni anno, al Ministero della salute, una dichiarazione sostitutiva di atto di notorietà ai sensi dell’art. 47 del decreto del Presidente della Repubblica n. 445/2000 per ogni acqua minerale riconosciuta, relativa al mantenimento delle caratteristiche proprie delle acque minerali naturali, sulle quali si basa il riconoscimento, unitamente a un’analisi chimica, chimico-fisica e organolettica e a un’analisi microbiologica effettuate nel corso dello stesso anno solare ed eseguite secondo le modalità previste, rispettivamente, dagli articoli 2 e 4.
Dette analisi devono essere eseguite su campioni prelevati alla sorgente (ovvero alle singole sorgenti se l’acqua proviene da più sorgenti in tale caso, anche alla miscelazione delle singole sorgenti nonché – qualora l’acqua minerale naturale sia sottoposta a un trattamento di cui all’art. 8, comma 1, lettere b, c, d, del decreto legislativo 8 ottobre 2011, n. 176 – su campioni prelevati all’uscita dell’impianto di trattamento e deve essere effettuata da laboratori autorizzati ai sensi del decreto del Capo del Governo 7.11.1939.
Il mancato invio della citata documentazione entro il 31 gennaio dell’anno successivo a quello di riferimento comporta la immediata sospensione della validità del decreto di riconoscimento.
2. La valutazione di conformità della certificazione analitica prodotta ai fini della verifica di cui al comma 1 è effettuata sentito il Consiglio superiore di sanità, nel cui ambito si esprime anche l’Istituto superiore di sanità.
3. Il Ministro della salute, con proprio decreto, dispone la revisione dei riconoscimenti delle acque minerali naturali per ogni necessità di adeguamento al progresso tecnico, alle nuove acquisizioni scientifiche, alle direttive emanate dall’Unione europea nonché per ogni esigenza di salvaguardia della salute pubblica o dei consumatori.
Art. 8
Abrogazioni
1. Ai sensi dell’art. 34, comma 3, del decreto legislativo 8 ottobre 2011, n. 176, dalla data di entrata in vigore del presente decreto è abrogato il decreto del Ministro della sanità 12 novembre 1992, n. 542.
Il presente decreto sarà pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana e comunicato alla Commissione europea.
ALLEGATO I
Caratteristiche (*) di prestazione delle metodiche analitiche per la determinazione dei parametri elencati nell’art. 2, comma 4.
ALLEGATO II
Gruppi o singole sostanze non ammesse
ALLEGATO III
Limiti massimi per i composti residui di trattamento delle acque minerali naturali con aria arricchita di ozono
ALLEGATO IV
Analisi microbiologiche delle acque minerali naturali
1. Norme generali
Il campione da esaminare deve essere costituito da aliquote di almeno 3L di acqua minerale ciascuna.
Alle fonti il prelievo viene effettuato con bottiglie sterili. Il Laboratorio deve curare la razionale conservazione dei campioni, mantenendo gli stessi a temperatura compresa tra +3°C e +5°C. Ove ciò non avvenga, la circostanza deve essere segnalata.
Il trasporto dei campioni viene effettuato con cassette coibentate e refrigerate in grado di assicurare il mantenimento dei medesimi a una temperatura compresa tra +3°C e +5°C. I campioni pervenuti al laboratorio debbono essere sottoposti alle analisi quanto prima possibile e al massimo entro 12 ore dal prelievo, mantenendo gli stessi a temperatura compresa tra +3°C e +5°C fino al momento delle analisi. Ove ciò non sia possibile la circostanza viene indicata nella relazione d’analisi.
2. Metodologia analitica
Tabella 1 – Parametri da determinare e metodologia analitica
2.1 Determinazione della Carica Microbica Totale (CBT)
Seminare in Plate Count Agar (1) volumi di 1 ml di acqua non diluita in quattro piastre di Petri. Incubare due piastre a 37°C ± 1 °C per 24 h ± 2 h e due piastre a 20 °C ± 1° C per 72 h ± 2 h. Procedere quindi alla conta delle colonie e alla relativa numerazione dei microrganismi.
2.2 Ricerca dei coliformi e degli E. coli
a) Metodo per insemenzamento in terreno liquido
Seminare due beute provviste di campanula, contenenti 125 ml di Brodo Lattosato a tripla concentrazione (2), rispettivamente con 250 ml di acqua. Incubare a 37 °C ± 1 °C per 48 h ± 2 h. Nel caso di prova presuntiva positiva (intorbidamento del terreno e formazione di gas nella campanula) procedere alle prove di conferma:
> seminare 0,1 ml della coltura presuntiva in provetta con campanula contenente 10 ml circa di Brodo Lattosio-Verde Brillante-Bile (3) e incubare a 37 °C ± 1 °C per 48 h ± 2 h;
> seminare 0,1 ml della coltura presuntiva in provetta, come alla lettera a) e incubare a 44 °C ± 0,5 °C per 48 h ± 2 h.
In assenza di formazione di gas nelle due provette di Brodo Lattosio-Verde Brillante-Bile, la prova di conferma risulta negativa (assenza di coliformi).
La presenza di gas nella sola provetta a 37 °C denota positività per i coliformi.
La presenza di gas in ambedue le provette (incubate rispettivamente a 37 °C e a 44 °C) denota positività per i coliformi fecali.
Dalle colture positive in Brodo Lattosio-Verde Brillante-Bile (sia a 37 °C che a 44 °C) procedere all’isolamento su Mac Conkey Agar (4) e incubare a 37 °C per 24h. Dalle colonie acidificanti isolate procedere con le prove biochimiche (H2 S, indolo, ornitina decarbossilasi) e valutare i risultati ottenuti ai fini dell’identificazione dei microrganismi.
b) Metodo per membrane filtranti
Filtrare due aliquote di 250 ml di acqua, ciascuna attraverso una membrana sterile di acetato di cellulosa (pori da 0,45µm). Porre le due membrane, rispettivamente, su piastre di Agar Lattosato al Tergitolo 7 (AT7) (5) da incubare a 36 °C ± 1 °C per 24 h ± 2h e di Agar Lattosato al Tergitolo 7 addizionato di Cloruro di Trifeniltetrazolio (AT7 + TTC) (6), da incubare a 44 °C ± 0,5 °C per 24 h ± 2h. Prelevare le colonie gialle cresciute su AT7 (coliformi presuntivi) e seminarle in provette contenenti campanula e 10 ml di Brodo Lattosio-Verde Brillante-Bile (3). Incubare le provette a 36 °C ± 1 °C.
Contemporaneamente prelevare le colonie gialle fino al rosso scure su AT7 + TTC (coliformi fecali presuntivi) e seminarle in provette contenenti campanula e 10 ml di Brodo Lattosio-Verde Brillante-Bile (3). Incubare le provette a 44 °C ± 0,5 °C per 48 h ± 2 h.
La presenza, dopo incubazione a 36 °C, di intorbidamento e gas denota positività per i coliformi.
La presenza, dopo incubazione a 44 °C, di intorbidamento e gas denota positività per i coliformi fecali. Dalle colture positive procedere alle prove di conferma come per il metodo in terreno liquido.
2.3 Ricerca degli Streptococchi fecali
a) Metodo per insemenzamento in terreno liquido
Seminare due beute contenenti 125 ml di Brodo Glucosio-Azide (7) a tripla concentrazione rispettivamente con 250 ml di acqua. Incubare a 37 °C ± 1 °C per 48 h ± 2 h. Nel caso di prova presuntiva positiva (intorbidamento del terreno) procedere alle prove di conferma mediante striscio su Agar Bile-Esculina-Azide (8). Incubare a 44 °C ± 0,5 °C per 44h ± 4h. Considerare positive le colonie nere catalasi negative.
b) Metodo per membrane filtranti
Filtrare due aliquote di 250 ml di acqua, ciascuna attraverso una membrana sterile di acetato di cellulosa (pori da 0,45µm). Porre le due membrane, rispettivamente, su piastre di KF streptococcus agar (9) e incubare a 37 °C ± 1 °C per 44h ± 4h. Sottoporre le colonie sospette che si presentano, con centro rosso, più raramente rosse o rosa, alle prove di conferma come per il metodo in terreno liquido.
2.4 Ricerca degli anaerobi sporigeni solfito-riduttori
Riscaldare un’aliquota di 50 ml di acqua a 80 °C per 10 minuti. Raffreddare rapidamente e filtrare per membrana (pori da 0,2µm). Porre la membrana su SPS Agar (10) ricoprendo con altri 10 ml di SPS Agar a 45 °C. Incubare a 37 °C ± 1 °C per 24h ± 1h in anaerobiosi.
La prova viene considerata positiva quando si sviluppano colonie nere.
Identificazione presuntiva di Clostridium perfrigens: prelevare le colonie sospette (nere con alone nero) e seminarle in provette contenenti 15 ml di Brodo Tioglicollato (11) riscaldato in bagnomaria bollente a 100 °C per 10 minuti e quindi rapidamente raffreddato. Incubare a 37 °C ± 1 °C per 24h ± 2h ed eseguire subcolture in:
a. Agar Nutritivo (12) a becco di clarino da incubare a 37 °C ± 1 °C per 24h ± 2h in anaerobiosi, per verificare la negatività della catalasi;
b. provetta di Latte Tornasolato (13) ricoperto con 2 ml di vaselina sterile, da incubare a 37°C per 24–48 h per verificare l’acidificazione e la formazione di un coagulo frammentato.
2.5 Ricerca delloStaphylococcus aureus
Filtrare un’aliquota di 250 ml di acqua attraverso membrana sterile di acetato di cellulosa (pori da 0,45µm). Porre la membrana su Baird Parker Agar (15) e incubare + 37 °C ± 1 °C per 24 h ± 2 h. Prelevare le colonie sospette (colonie nere generalmente con alone) e seminarle in Brain-Heart Infusion Broth (16). Incubare a 37 °C ± 1 °C per 24 h ± 2 h.
Procedere con le prove biochimiche.
2.6 Ricerca di Pseudomonas aeruginosa
Filtrare un’aliquota di 250 ml di acqua attraverso membrana sterile di acetato di cellulosa (pori da 0,45µm). Porre la membrana su Agar Cetrimide (14) e incubare + 37 °C ± 1 °C per 48 h ± 2 h. Prelevare le colonie sospette (verdi-bluastre e/o fluorescenti agli UV) e trasferirle su nutrient agar a becco di clarino. Incubare a 42 °C ± 0.5 °C per 48 h ± 2 h.
Dalla patina procedere alla verifica della positività della ossidasi su cartine alla dimetil-pfenilendiamina.
In caso di positività al test dell’ossidasi procedere all’identificazione mediante prove biochimiche.
2.7 Parametri da determinare in caso di sospetta contaminazione e metodologia analitica
3. Memorandum tecnico
Terreni di coltura
9. T 7 – TTC
Come il terreno AT 7 aggiungendo cloruro di trifeniltetrazolio (TTC) mg 35/litro.
L’integrazione va fatta addizionando asetticamente a 1 litro di terreno sterilizzato e raffreddato a 50 °C. 3,5 ml di una soluzione acquosa sterile all’1% di 2.3.5 trifeniltetrazolio cloruro.
Dr. Luciano O. Atzori
Consigliere Segretario dell’Ordine Nazionale dei Biologi
Coordinatore della Commissione permanente di Studio dell’ONB “Igiene, Sicurezza e Qualità”
Delegato nazionale per l’Igiene, la Sicurezza e la Qualità
Coordinatore del Comitato EXPO2015 dell’ONB
Esperto in Sicurezza degli Alimenti e in Tutela della Salute
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