L’articolo originale in lingua inglese è disponibile su Zenodo.org
Recentemente è stata segnalata la frequente associazione tra COVID -19 e altre diverse manifestazioni cliniche extrapolmonari in pazienti sintomatici.
I dati riportati di seguito suggeriscono un’associazione tra COVID-19 e il rilascio nell’organismo di (oligo-) peptidi) quasi identici a componenti tossici di veleni di origine animale. La presenza di questi peptidi apre nuovescenari sull’eziologia dei sintomi clinici da COVID-19osserrvati sino ad ora, incluse manifestazioni neurologiche.
INTRODUZIONE
Sono state segnalate numerose manifestazioni cliniche extra-polmonari che si associano alla malattia COVID-19 (per esempio manifestazioni di tipo neurologiche, emorragiche e trombotiche) e l’evidenza della loro severità e persistenza è in incremento. Gupta e Co. Hanno revisionato la fisiopatologia organo-specifica di tipo extra-polmonare di pazienti con COVID-19 “per aiutare medici e scienziati a riconoscere e monitorare lo spettro di manifestazioni, e nello sviluppo di priorità di ricerca e strategie terapeutiche per tutti i sistemi di organi coinvolti1”.
Liotta e Co. , hanno caratterizzato l’incidenza delle manifestazioni neurologiche nella coorte di pazienti ospedalizzazione con COVID-19 confermato : le più frequenti sono risultate essere mialgia, mal di testa, encefalopatia, vertigini,anosmia; l’encefalopatia è risultata essere “ associata con una maggiore morbilità e mortalità, indipendentemente dalla severità della patologia respiratoria2”. Se queste manifestazioni siano connesse ad altri disordini associati all’infezione da SARS-CoV2, è ancora oggetto di discussione. Frontera e Co., uno studio prospettico, multicentrico, osservazionale in adulti ospedalizzati con infezione da SARS-CoV2 confermata da test di laboratorio, ha concluso che “ i disordini neurologici sono stati riscontrati nel 13.5% dei pazienti con COVID-19 durante la durata dello studio. Molti di questi disordini neurologici si verificano comunemente tra pazienti con malattia critica. Encefaliti, meningiti o mieliti riconducibili all’infezione da SARS-CoV2, non si sono verificate, sebbene la Sindrome di Guillain Barre è stata identificata nel post infezione. Complessivamente, i disordini neurologi nel contesto dell’infezione da SARS-CoV2, conferiscono un più alto rischio mortalità intra-ospedaliera e ridotta probabilità di dimissione3”.
Studi nell’uso della spettrometria di massa in pazienti con COVID-19 si focalizzano sulla ricerca di molecole infiammatorie umane che risultano in aumento per essere usate come biomarcatori per valutare lo stato di gravità del COVID-19 (vedi per esempio il lavoro di Messner e Co.)4 il nostro intento è stato quello di usare la spettrometria per scoprire l’eventuale presenza di molecole suggerite dalla descrizione clinica dei sintomi neurologici, da coagulazione e sintomi infiammatori.
Perciò, il nostro approccio è iniziato dalle manifestazioni cliniche di COVID-19 descritte (quali iposmia, disgeusia ecc)
In questo studio presentiamo i risultati delle ns. analisi mediante l’uso della spettrometria di massa, abbiamo trovato peptidi simili a tossine in campioni di plasma ed urine di pazienti affetti da COVID-19, ma non nei campioni del controllo. Poiché i nostri risultati non corrispondono con il pensiero corrente riguardo l’eziologia correlata alle manifestazioni cliniche osservate in pazienti con COVID-19, riteniamo che la condivisione immediata con la comunità scientifica sia fondamentale.
DISEGNO SPERIMENTALE
Campioni usati nel presente studio: campioni di plasma raccolti da 5 pazienti con COVID-19 provenienti da diverse città italiane e da 5 soggetti di controllo (per esempio negativi ai test per SARS-CoV-2 e non affetti da cancro o patologie autoimmuni) e da campioni di urine provenienti da due ulteriori pazienti con COVID-19 e da 2 soggetti di controllo.
Tutti i campioni sono stati analizzati per la presenza di proteine con potenziale effetto tossico usando la spettrometria di massa a mobilità ionica (CIMS), in associazione con l’elettronebulizazzione chimica attivata in superficie (surface activated chemical ionization-Electrospray-NIST) (SANIST) e secondo la ricerca nel database come da modello Bayesian (SANIST-CIMS), come descritto in riferimento 5, 6. Il set completo “delle tossine e proteine velenose annotate manualmente sul database UniprotKB”7 (mescolato con un sottoinsieme di proteine e tossine non velenose del database UniprotKB al fine di dare un significato statistico ai risultati) è stato usato come riferimento per set di dati sulle proteine.
I dettagli relativi ai materiali e metodi sono dettagliati nei file supplementari.
RESULTS RISULTATI
La presenza di (oligo-) peptidi caratterizzati come componenti tossici in veleni animali è stata osservata in campioni di plasma e urine di pazienti infetti da SARS-CoV-2, e mai in campioni di plasma ed urine provenienti dai sogetti del gruppo di controllo. (non affetti). Diversi (oligo-) peptidi (tra 70 e 115,a secondo del campione analizzato) corrispondono a tossine e proteine di veleni animali come conotossoine, fosfolipasi A2, metallo-proteinasi (86% dei test hanno un log(e) più alto di 25).
Nella tabella 1 è riportato un elenco di 36 proteine coperte dai peptidi simili alle tossine trovate. Una selezione di uno spettro rappresentativo di 30 di esse è riportato in materiale supplementare (figura S1).
Alcuni dei peptidi tossino-simili scoperti e mappati sulla stessa proteina di riferimento
(UniprotKB:D2DGD8), sono riportati in figura1: questi peptidi sono stati rinvenuti in 5 campioni di plasma. È Interessante come, osservando le caratteristiche dei peptidi tossino-simili mappati sulle proteine note per essere secrete e processate, in alcuni casi abbiamo notato che la regione funzionale C-terminale era abbondante nei campioni di plasma,mentre il peptide segnale e il pro peptide (N-terminale) erano più abbondanti nei campioni di urina (dati in preparazione , ancora non disponibili).
DISCUSSIONE
Le tipologie di petidi tossino-simili scoperte somigliano a note conotossine, fosfolipasi A2, metallo-proteinasi, attivatori della protrombina, fattori di coagulazione, normalmente presenti nei veleni animali, che sono noti per avere un’alta specificità e affinità verso i canali ionici, recettori e trasportatori del sistema nervoso presenti nell’uomo, come il recettore nicotinico per l’acetilcolina. Quello che segue è il nostro tentativo di comprendere la potenziale relazione tra la loro presenza e la sintomatologia extrapolmonare da COVID-19.
CONOTOSSINE
Le conotossine sono un gruppo di peptidi neurotossici isolate dal veleno delle lumache cono marine , del genere Conus. Le cono tossine mature sono formate da 10 a 30 amminoacidi e hanno tipicamente unoo più ponti di solfuro. Queste strutture di ponti di solfuro sono usate per definire la classe strutturale celle cono tossine ( le maggiori classi sono μ-conotoxins, ω-conotoxins, e α-conotoxins). Esse sono solubili n acqua e hanno diversi meccanismi di azione , la maggior parte di cui non è ancora stata determinata8 . Ad ogni modo, è stato dimostrato che molti di questi peptidi modulano l’attività di diversi recettori, incluso canali ionici, recettori nicotinici per l’acetilcolina (nAChRs) ed enzimi (acetilcolina-esterasi) che degrada l’acetilcolina, dunque provocando un’alterazione dei livelli di acetilcolinae della trasmissione colinergica.9,10,11
La presenza di peptidi conotossino-simili, potrebbe spiegare l’occorrenza di molti sintomi (come ipsomia, ipogeusia e segni tipici della sindrome di Guillan-Barre) osservati in alcuni pazianti con COVID-19. La loro presenza puà alterare il normale funzionamento dei canali ionici, recettori nicotinicii per l’aceticolina e i livelli di aceti colina.
FOSFOLIPASI A2.
Le fosfolipasiA2 (PLA2, E.C. 3.1.1.49 idrolizzano i fosfolipidi e portano al rilascio dell’acido fosfolipidicoe dell’acido arachidonico12. L’acido arachidonico è il precursore di molti mediatori pro-infiammatori come leucotrieni, trombassanie prostaglandine; come conseguenza, una presenza fuori ranfe del PLA2 attivo può indurre grave infiammazione13.
Nei veleni di animali PLA2 agisce come le proteine neurotossiche che legano e idrolizzano i fosfolipidi di membrana dei terminali del nervo motore(e nello più dei casi, la membrana plasmatica del muscolo scheletrico) determinando una grave risposta infiammatoria degenerativa che conduce alla degenerazione del terminale nervoso e del muscolo scheletrico.12 Il farmaco desametasone è in grado di inibire la sintesi delle prostaglandine e la formazione dei leucotrieni.14 Dal momento che il desametasone continua ad essere l’unica terapia dimostratasi effettiva nei pazienti con il nuovo coronavirus 15 con sintomi severi, può essere che l’effetto positivo di questo farmaco sui pazienti con COVID-19 sia anche dovuto alla riduzione del peptide simile al PLA2 identificato.
METALLOPROTEINASI
L’ultimo esempio di peptidi tossino-simili identificati è quello delle metallo proteinasi presenti nei veleni animali, enzimi zinco-dipendenti aventi peso molecolare variabile ed un’organizzazione multidominio. Questi enzimi tossici causano emorragia, mio necrosi locale, danno cutaneo, reazioni infiammatorie.16 E’ stato riportato che pazienti COVID-19 sintomatici hanno significativamente più bassi liveli di zinco rispetto ai controlli e che lo zinco è deficitario n pazienti che sviluppano più complicazioni.17
La presenza di questo specifico gruppo di peptidi tossino-simili, che sequestra zinco, può essere la ragione per tali livelli significativamente bassi di zinco in pazienti COVID-19 sintomatici.
Simili ricerche di TBLASTN18 con liberi parametri sul sito del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (vedi Materiali e Metodi) hanno rivelato (in aggiunta alle sequenze di mRNA da specie di animali riportati in tabella 1) brevi tratti quasi identici (fino a 10 amminoacidi) di questi peptidi in regioni potenzialmente codificanti in molte sequenze batteriche e virali, ma non è stata trovata una lunga regione potenzialmente codificante che comprenda interamente alcuni di essi.
Di conseguenza, al momento in cui scriviamo, non è ancora stato identificata “ la sorgente genetica” di questi peptidi che potrebbe essere:
- Il genoma ad RNA del SARS-CoV-2 il suo set proteico di lettura, come proposto da Brogna19, che ha riportato l’identificazione nel RNA del SARS-CoV-2 di molte regioni codificanti per oligopeptidi (lunghi 4-5 amminoacidi) identici ai peptidi delle neurotossine tipiche dei veleni animali.
- Il genoma di SARS-CoV-2 direttamente letto dai batteri, assumendo che l’intero genoma SARS-CoV-2 o parte di esso, sia in grado di replicarsi con modalità simili alla batteriofagia, come precedentemente descritto20.
- Genomi di batteri, che, in reazione alla presenza del virus, producono questi peptidi. Questo potrebbe verificarsi attraverso meccanismi controversi ed ancora non ben conosciuti, come la lettura alternativa dovuta all’eterogeneità della sequenza del mRNA (come descritto in 21, 22) o il coinvolgimento di piccoli ncRNA (sRNA) batterici, noti per essere importanti regolatori dell’espressione genica sottospecifiche condizioni (come in risposta allo stress, qourum sensing e virulenza; Colema e Co., nel 1984 descrissero la prima evidenza dela funzione del sRNAdi origine batterica con la caratterizzazione di RNA bon codificante micF23.
- Una combinazione delle precedenti alternative: per esempio la il codice genetico “tossina” è presente nei batteri e l’espressione potrebbe essere attivato da SARS-CoV-2, che agisce come i batteriofagi, noti per interagire con i batteri così che possano esprimere (o meno ) alcuni geni, come descritto da Carey e Co., 24.
Un’analisi dettagliata sulla similitudine della struttura in 3D tra i peptidi tossino-simili scoperti e le proteine di riferimento non è stata ancora condotta. Di conseguenza, al momento del presente lavoro, possiamo solo supporre che questi peptidi tossino-simili siano coinvolti nelle manifestazioni cliniche extrapolmonari nei pazienti COVID-19 sintomatici. In aggiunta, secondo la nostra conoscenza, questi peptidi non sono mai stati ricercati negli animali considerati serbatoi di SARS-CoV-2. I risultati qui riportati sollevano interrogativi aggiuntivi a quelli già elencati da noi nel 20.
- Sono queste scoperte in linea con quanto proposto da Tizabi e Co.,24, per esempio nel COVID-19 è presente un ruolo potenzialmente terapeutico della nicotina, dei suoi agonisti, o modulatori allosterici positivi o recettori colinergici nicotinici?
- Se indotta da SARS-CoV-2, la produzione dei peptidi tossino-simili può essere coinvolta nei disordini neurologici e nei danni osservati nei pazienti ospedalizzati per COVID-19?
- Se indotto da SARS-CoV-2, può la produzione di peptidi tossino-simili influenzare malattie complesse apparentemente innescate o potenziate da COVID-19, come ad es. la Sindrome di Guillain-Barré25 o morbo di Parkinson26?
- I peptidi tossno-simili sono associati all’infezione da SARS-CoV-2 o ad altri
infezioni virali o, più in generale, la loro presenza è correlata alla condizione della malattia?
- Le nostre scoperte supportano il suggerimento del consorzio iVAMP27 sulla relazione tra le ghiandole velenifere animali e microambienti dei microrganismi?
Consideriamo che l’immediata condivisione di questi risultati possano contribuire a districare l’insieme multiforme delle manifestazioni cliniche nei pazienti COVID-19e alla futura comprensione dei meccanismi coinvolti.
L’articolo originale in lingua inglese è disponibile su Zenodo.org
REFERENCES
1 Gupta A, Madhavan M V., Sehgal K, et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nat Med 2020; 26: 1017–32.
2 Liotta EM, Batra A, Clark JR, et al. Frequent neurologic manifestations and encephalopathy-associated morbidity in Covid-19 patients. Ann Clin Transl Neurol 2020; : acn3.51210.
3 Frontera JA, Sabadia S, Lalchan R, et al. A Prospective Study of Neurologic Disorders in Hospitalized COVID-19 Patients in New York City. Neurology 2020; : 10.1212/WNL.0000000000010979.
4 Messner CB, Demichev V, Wendisch D, et al. Ultra-High-Throughput Clinical Proteomics Reveals Classifiers of COVID-19 Infection. Cell Syst 2020; 11: 11-24.e4.
5 Arzoni A, Bernardi LR, Cristoni S. In-source cloud ion mobility mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2015; 29: 690–4.
6 Cristoni S, Dusi G, Brambilla P, et al. SANIST: optimization of a technology for compound identification based on the European Union directive with applications in forensic, pharmaceutical and food analyses. J Mass Spectrom 2017; 52: 16–21.
7 UniprotKB. Animal toxin annotation project. https://www.uniprot.org/program/Toxins (accessed Oct 4, 2020).
8 Layer R, McIntosh J. Conotoxins: Therapeutic Potential and Application. Mar Drugs 2006; 4: 119–42.
9 Cestèle S. Molecular mechanisms of neurotoxin action on voltage-gated sodium channels. Biochimie 2000; 82: 883–92.
10 Lebbe E, Peigneur S, Wijesekara I, Tytgat J. Conotoxins Targeting Nicotinic Acetylcholine Receptors: An Overview. Mar Drugs 2014; 12: 2970–3004.
11 Prasasty V, Radifar M, Istyastono E. Natural Peptides in Drug Discovery Targeting Acetylcholinesterase. Molecules 2018; 23: 2344.
12 Harris J, Scott-Davey T. Secreted Phospholipases A2 of Snake Venoms: Effects on the Peripheral Neuromuscular System with Comments on the Role of Phospholipases A2 in Disorders of the CNS and Their Uses in Industry. Toxins (Basel) 2013; 5: 2533–71.
13 Teixeira C, Fernandes CM, Leiguez E, Chudzinski-Tavassi AM. Inflammation Induced by Platelet-Activating Viperid Snake Venoms: Perspectives on Thromboinflammation. Front Immunol 2019; 10.
DOI:10.3389/fimmu.2019.02082.
14 Goppelt-Struebe M, Wolter D, Resch K. Glucocorticoids inhibit prostaglandin synthesis not only at the level of phospholipase A2 but also at the level of cyclo-oxygenase/PGE isomerase. Br J Pharmacol 1989; 98: 1287–95.
15 Dexamethasone in Hospitalized Patients with Covid-19 — Preliminary Report. N Engl J Med 2020; : NEJMoa2021436.
16 Teixeira C de FP, Fernandes CM, Zuliani JP, Zamuner SF. Inflammatory effects of snake venom metalloproteinases. Mem Inst Oswaldo Cruz 2005; 100: 181–4.
17 Jothimani D, Kailasam E, Danielraj S, et al. COVID-19: Poor outcomes in patients with zinc deficiency. Int J Infect Dis 2020; 100: 343–9.
18 Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 1990; 215: 403–10.
19 Brogna C. The Covid-19 Virus Double Pathogenic Mechanism. A New Perspective. 2020 DOI:10.20944/preprints202004.0165.v2.
20 Petrillo M, Brogna C, Cristoni S, Querci M, Piazza O, Van den Eede G. Increase of SARS-CoV-2 RNA load in faecal samples prompts for rethinking of SARS-CoV-2 biology and COVID-19 epidemiology. 2020; published online Oct 14. DOI:10.5281/ZENODO.4088208.
21 Lilleorg S, Reier K, Volõnkin P, Remme J, Liiv A. Phenotypic effects of paralogous ribosomal proteins bL31A and bL31B in E. coli. Sci Rep 2020; 10: 11682.
22 Chen Y-X, Xu Z-Y, Ge X, et al. Selective translation by alternative bacterial ribosomes. Proc Natl Acad Sci U S A 2020; 117: 19487–96.
23 Coleman J, Green PJ, Inouye M. The use of RNAs complementary to specific
mRNAs to regulate the expression of individual bacterial genes. Cell 1984;37: 429–36.
24 Carey JN, Mettert EL, Fishman-Engel DR, Roggiani M, Kiley PJ, Goulian M. Phage integration alters the respiratory strategy of its host. Elife 2019; 8. DOI:10.7554/eLife.49081.
25 Toscano G, Palmerini F, Ravaglia S, et al. Guillain–Barré Syndrome Associated with SARS-CoV-2. N Engl J Med 2020; 382: 2574–6.
26 Pavel A, Murray DK, Stoessl AJ. COVID-19 and selective vulnerability to Parkinson’s disease. Lancet Neurol 2020; 19: 719.
27 Ul-Hasan S, Rodríguez-Román E, Reitzel AM, et al. The emerging field of venom-microbiomics for exploring venom as a microenvironment, and the corresponding Initiative for Venom Associated Microbes and Parasites (iVAMP). Toxicon X 2019; 4: 100016.
